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诱导人骨髓间充质干细胞分化为角膜上皮细胞的实验研究

目的:探讨人骨髓间充质干细胞分化为角膜上皮细胞的可行性及诱导条件;方法:常规密度梯度离心-贴壁法筛选、扩增人骨髓间充质干细胞,CellTrakerTMGreen CMFDA标记细胞;组织块法培养兔角膜缘上皮细胞。将两种细胞共培养1周,观察骨髓间充质干细胞表达角膜上皮细胞特殊分化标

诱导人骨髓间充质干细胞分化为角膜上皮细胞的实

验研究1

许传超1,2,刘祖国2,3,*,刘扬1,2,陈小平1,2

1中山大学中山眼科中心,广州(510060)

2中山大学眼表疾病研究中心,广州(510060)

3厦门大学医学院眼科研究所,福建厦门(361005)

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摘 要:目的:探讨人骨髓间充质干细胞分化为角膜上皮细胞的可行性及诱导条件;方法:常规密度梯度离心-贴壁法筛选、扩增人骨髓间充质干细胞,CellTrakerTMGreen CMFDA标记细胞;组织块法培养兔角膜缘上皮细胞。将两种细胞共培养1周,观察骨髓间充质干细胞表达角膜上皮细胞特殊分化标志keratin 3的情况;结果:经过1周共培养的诱导,骨髓间充质干细胞开始表达较低水平的keratin 3;结论:骨髓间充质干细胞具有分化为角膜上皮细胞的 潜能。

关键词: 骨髓间充质干细胞;角膜上皮细胞;诱导;分化

各种原因(如化学伤、Steven-Jonson综合症、严重干眼等)所引起的严重角膜缘干细胞功能障碍而导致的眼表面损坏是最常见的角膜及眼表疾病之一。迄今为止,角膜缘干细胞移植重建角膜缘的功能是治疗角膜缘干细胞功能障碍唯一有效的手段[1,2]。然而,如何获得健康、足量的角膜缘干细胞供体是目前制约这种治疗手段应用的重要因素。

间充质干细胞(MSCs)由于它不涉及伦理问题、来源方便等优点,备受组织工程领域种子细胞研究者的关注。近年来,大量的研究表明,MSCs具有向多个胚层细胞分化的能力,是一种多能干细胞[3,4]。但其能否分化为角膜上皮细胞商未见报道。本研究采用MSCs与角膜上皮细胞共培养的方法,初步证实MSCs具备向角膜上皮细胞分化的潜力,为今后利用MSCs解决临床角膜缘干细胞缺乏类疾病奠定实验基础。

1. 材料和方法

1.1 试剂

DMEM-LG(Gibco);DMEM/F12(Gibco);胎牛血清(FCS,Gibco);胰蛋白酶(Amerson);淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque 1.077g/ml,上海华精);免疫荧光抗体:(R-PE)-mouse anti-human CD29;(FITC)-mouse anti-human CD34;(APC)-mouse anti-human CD44;(R-PE)-mouse anti-human CD45,均为BD公司产品;mouse anti-human keratin 3/12 (chemicon);Cy3-sheep anti mouse IgG (Sigma);CellTrakerTM Green CMFDA (invitrogen);

1.2 方法

1.2.1 hMSCs分离和体外扩增

健康成年肋骨来自外科手术中舍弃的标本。PBS彻底冲洗骨表面的血迹后,用无菌注射器吸取无血清的DMEM-LG培养液反复多次抽吸、冲洗骨髓腔,最;;;后将骨髓细胞悬液常规离心后弃去表面的脂肪层和上清,再次用PBS重悬,用密度梯度离心法分离单个核细胞层,DMEM培养液洗涤、离心3次,最后用含10%FCS的DMEM-LG重悬和计数,以1本课题得到高等学校博士点专项科研基金(20040558076)、国家自然科学基金(30371514)和广东省科技计划项目重大专项(2003A3020106)的资助。

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